摘要 從細胞凋亡的分子機制來分析細胞凋亡與胰腺炎之間的關(guān)系，并簡要綜述實驗性胰腺炎的凋亡誘導(dǎo)治療

　　近年的研究證實細胞凋亡參與胰腺炎的病理生理過程，但要從本質(zhì)上闡明細胞凋亡與胰腺炎之間的關(guān)系應(yīng)從細胞凋亡的分子機制來進行研究?，F(xiàn)在認(rèn)為細胞調(diào)亡參與胰腺炎發(fā)病主要有兩種機制：一類是受基因調(diào)控；另一類則是非基因調(diào)控。

　　1基因調(diào)控

　　受基因調(diào)控的細胞調(diào)亡又稱為程序性細胞死亡。一般分為兩類：一類是直接調(diào)控，如癌基因；另一類則是間接調(diào)控。如生物活性分子，通過誘導(dǎo)癌基因的表達發(fā)揮調(diào)控作用。

　　癌基因中bc1-2基因家族是zui受關(guān)注的與細胞凋亡相關(guān)的基因之一。Wada等[1]對胰管結(jié)扎（PDL）鼠應(yīng)用抗bc1-2單克隆抗體和抗增殖細胞核抗原（PCNA）單克隆抗體以免疫印跡和免疫組化方法對bc1-2和PCNA進行檢測。結(jié)果顯示，PDL鼠胰腺導(dǎo)管上皮細胞的bc1-2表達在第四、五天高于對照組2~5倍。bc1-2和PCNA免疫染色在對照組的胰腺導(dǎo)管上皮為微弱的染色，而在PDL鼠胰腺導(dǎo)管皮bcl-2和PCNA免疫染色陽性細胞數(shù)量增加，分別在第二天和第三天達zui高值。該結(jié)果表明，bc1-2具有抑制胰腺導(dǎo)管上皮細胞凋亡的功能。為進一步研究bc1-2基因家族中各基因的作用，Miyamoto等[2]研究PDL和雨蛙肽誘導(dǎo)急性胰腺炎兩種鼠實驗?zāi)Ｐ秃腿寺宰枞砸认傺祝–OP）胰腺外分泌細胞bc1-2家族相關(guān)基因的表達。結(jié)果顯示，在正常胰腺未見bc1-2基因家族表達；在PDL組胰管結(jié)扎后1天在胰腺細胞即觀察到bax和bc1-x表達，且在第二、三天尤為顯著，而其時胰腺腺細胞也發(fā)生凋亡。同時導(dǎo)管細胞增加形成導(dǎo)管管狀復(fù)合體，導(dǎo)管細胞內(nèi)bc1-2、bc1-x染色增加并在第五天達zui大值。鼠急性胰腺炎模型注射雨蛙肽后8小時和48小時發(fā)現(xiàn)胰腺細胞凋亡，同時應(yīng)用免疫組化方法觀察到胰腺細胞中存在 bax和bc1-x表達。COP時導(dǎo)管管狀復(fù)合體導(dǎo)管細胞bc1-2、bc1-x、mc1-1染色陽性，但bax染色陰性。上述結(jié)果表明，在兩種鼠胰腺炎模型中胰腺細胞內(nèi)bax誘導(dǎo)細胞調(diào)亡；而bc1-2、mc1-1可能在防止導(dǎo)管細胞凋亡和形成導(dǎo)管管狀復(fù)合體中起作用；bc1-x有既可誘導(dǎo)又可抑制細胞凋亡的雙重作用。雖然許多實驗證明bc1-2基因家族在胰腺細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，但其作用機制尚未*闡明。

　　癌基因中另一個與細胞凋亡相關(guān)的基因是被稱為“基因組衛(wèi)士”的野生型p53。Maacke等[3]在行ERCP時收集了27例慢性胰腺炎病人胰液細胞學(xué)標(biāo)本，并應(yīng)用一系列p53特異性單抗PAb1620、PAb1801、PAb240及CM-1（人重組p53多克降抗血清）以免疫過氧化酶染色觀察p53表達情況，同時以TUNEL法檢測調(diào)亡細胞。結(jié)果示，27例慢性胰腺炎病人中有16例（59%）p53蛋白表達陽性，11例PAb1620表達陽性，同時發(fā)現(xiàn)有凋亡細胞。可能的機制是慢性胰腺炎時氧自由基和一氧化氮基團損傷DNA。p53表達增加可能是DNA損傷的結(jié)果，并在DNA損傷的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)細胞調(diào)亡。有人認(rèn)為野生型p53提高細胞內(nèi)bax蛋白表達使得bc1-2/bax比例失衡而促進細胞凋亡[4]。

　　在基因調(diào)控與細胞凋亡關(guān)系的研究中，另一熱點課題是一些間接調(diào)控細胞凋亡的生物活性分子，如轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）β、腫瘤壞死因子（TNF）等。zui近，Subramanian等[5]從源于人中胚層的成骨細胞中識別一種TGF-β調(diào)控的鋅指編碼基因的TIEG（TGF-β誘導(dǎo)的早期基因）與胰腺炎細胞凋亡有關(guān)。為進一步研究TGF-β在胰腺外分泌細胞群中的表達、功能及其調(diào)控機制，Tachibana等[6]對培養(yǎng)的鼠胰腺AR42J細胞和人五種胰腺外分泌細胞PANC1、MIAPaCa2、BxPC3、HST66T和Capan1進行免疫印跡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這六種外分泌細胞中均有豐富的TIEG mRNA表達。應(yīng)用純化的TIEG親和抗體進行定位檢查發(fā)現(xiàn)TIEG存在于正常人胰腺外分泌部導(dǎo)管和腺細胞群。研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TGF-β處理上述細胞2小時后可見TIEG表達上調(diào)。為進一步觀察TIEG的表達增加是否誘導(dǎo)胰腺外分泌細胞凋亡，用5ng/ml tGF-β1處理PANC1細胞24小時、48小時和72小時，結(jié)果顯示，在任一時間點TGF-β1都增加凋亡率，尤以72小時后為zui甚。為進一步證實TIEG表達具有增加誘導(dǎo)凋亡功能，還進行了轉(zhuǎn)染實驗。用10μg表達TIEG載體（pMEX-neo-TIEG）轉(zhuǎn)染PANC1細胞和僅轉(zhuǎn)染對照載體（pMEX-neo）的PANC1細胞及未轉(zhuǎn)染細胞進行研究。MTS增殖分析結(jié)果示，未轉(zhuǎn)染細胞和pMEX-neo細胞生長正常；pMEX-neo-TIEG細胞增殖停止，而且72小時后pMEX-neo-TIEG細胞量較實驗初低。DNA梯形圖譜分析表明，pMEX-neo-TIEG細胞凋亡數(shù)在任一時刻均超過30%，而且還發(fā)現(xiàn)pMEX-neo-TIEG細胞凋亡率比TGF-β1處理的PANC1細胞凋亡率高，這可能是觀察到的TGF-β1處理的PANC1細胞TIEG上調(diào)是瞬時的，而pMEX-neo-TIEG細胞內(nèi)的TIEG上調(diào)則是穩(wěn)定的。因此，TGF-β誘導(dǎo)的TIEG表達增加可誘導(dǎo)細胞凋亡。

　　還有一些資料表明，TNF是介導(dǎo)細胞凋亡的介質(zhì)[7]，可能的機制是TNF激活T細胞表達Fas配體，F(xiàn)as配體再與靶細胞結(jié)合促使靶細胞凋亡。

　　不僅TGF-β、TNF這些因子通過誘導(dǎo)癌基因表達發(fā)揮調(diào)控作用，而且一些生物活性物質(zhì)也有類似的機制。有學(xué)者報道，用維生素K3和超過生理濃度的雨蛙肽（＞10-10M）[8]和用低濃度peroxynitrite（2~5μM）[9]分別培養(yǎng)鼠胰腺AR42J細胞，結(jié)果均可觀察到細胞凋亡現(xiàn)象，且發(fā)現(xiàn)野生型p53表達增加。上述結(jié)果表明，一些生物活性物質(zhì)可能通過野生型p53表達增加誘導(dǎo)細胞凋亡。

　　2非基因調(diào)控

　　近年來，盡管有關(guān)蛋白質(zhì)和RNA合成抑制劑抑制凋亡研究已證實蛋白質(zhì)大分子合成是凋亡的另一重要生化特征，同時證實細胞凋亡是一種由內(nèi)在基因編碼調(diào)控的細胞死亡方式[10]。但也有Fas介導(dǎo)細胞凋亡不依賴蛋白質(zhì)合成的報道[11]。一些損傷因子直接或間接損傷DNA而致細胞凋亡，如缺血再灌注等。這些現(xiàn)象表明凋亡除受基因調(diào)控外還受非基因調(diào)控。

　　Fujimoto等[12]用血管鉗鉗夾鼠胰腺下方的脾動脈1小時后再松開血管鉗造成選擇性胰尾部缺血再灌注的實驗?zāi)Ｐ?，然后用DNA凝膠電泳方法觀察細胞凋亡情況，結(jié)果在缺血再灌注后48小時觀察到胰腺細胞凋亡的典型DNA梯形圖譜。該實驗表明，缺血再灌注可誘導(dǎo)胰腺細胞凋亡，但其機制尚不太清楚。

　　盡管從凋亡的分子機制研究凋亡與胰腺炎關(guān)系取得了一些進展，但仍需進一步闡明凋亡在胰腺炎中的確切作用機制，從而使之應(yīng)用于臨床實踐。

　　新近，Matsuzaki等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎的急性階段很少觀察到細胞凋亡，但在急性期后恢復(fù)階段則見大量細胞凋亡。而Tanaka等[14]研究觀察到，在不同的慢性胰腺炎實驗?zāi)Ｐ椭酗@示凋亡的顯著性。這些結(jié)果表明，細胞凋亡可能是胰腺炎病理生理中的一個環(huán)節(jié)，可能使胰腺炎向好的方向發(fā)展，亦可能使病情惡化。

　　3實驗性胰腺炎的凋亡誘導(dǎo)治療

　　Kaiser等[15]報道，在五種急性胰腺炎模型中急性胰腺炎嚴(yán)重程度與凋亡呈負(fù)相關(guān)現(xiàn)象，即在阻塞鼠膽胰共同通路和輸注大劑量雨蛙肽誘導(dǎo)的輕度胰腺炎中可觀察到細胞凋亡，而在阻塞負(fù)鼠膽胰共同通路和年幼雌鼠CDE飲食（無膽堿而乙硫氨酸充足的食物）誘導(dǎo)的重癥胰腺炎則觀察到壞死。凋亡與胰腺炎嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，表明細胞凋亡可能是對胰腺損傷的有利反應(yīng)。zui近有研究提出，誘導(dǎo)細胞凋亡可減輕胰腺炎的嚴(yán)重程度。Saluja等[16]報道，在細胞凋亡存在條件下可減輕雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺炎嚴(yán)重程度。給予實驗鼠5周大豆飲食后轉(zhuǎn)為正常飲食27小時，然后重復(fù)注射超大劑量雨蛙肽50μg·kg-1·h-1共12小時誘導(dǎo)胰腺炎，對照組給予5周正常飲食后注射同樣劑量的雨蛙肽誘導(dǎo)胰腺炎。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5周大豆飲食繼而轉(zhuǎn)為正常飲食后，原來肥大的胰腺腺體迅速縮小，并且觀察到縮小期間伴有大量的腺細胞凋亡，在縮小期間注射雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺炎炎癥程度為2+，而對照組炎癥為4+（4+表示廣泛的炎癥，0表達無炎癥）。結(jié)果表明，在腺細胞凋亡時注射雨蛙肽，可減輕其誘導(dǎo)的胰腺炎嚴(yán)重程度。為進一步證實上述結(jié)果，Kaiser等[10]在結(jié)扎鼠膽胰共同通路誘導(dǎo)胰腺炎后給予蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)已酰亞胺以抑制細胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制細胞凋亡后加重胰腺炎病變程度。另外一些學(xué)者用實驗證明DA-9601[17]和1-cyano-2-hydroxy-3-butene（CHB）[18]誘導(dǎo)細胞凋亡也減輕了雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺炎嚴(yán)重程度。

　　由此可見，誘導(dǎo)調(diào)亡可能會降低胰腺炎的嚴(yán)重程度。盡管這些研究于動物實驗水平，但仍顯示出細胞凋亡用于胰腺炎臨床實踐的美好前景。相信隨著細胞凋亡的繼續(xù)深入研究，必將有助于揭示胰腺炎的發(fā)病機制，并有可能提高胰腺炎的診療水平。