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小鼠FMS樣酪氨酸激酶3配體 （Flt-3L）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒使用說明書
發(fā)布時間： 2013-08-27 點擊次數(shù)： 1805次檢測原理:
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗小鼠FMS樣酪氨酸激酶3配體 （Flt-3L）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒包被于酶標(biāo)板上，實驗時標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品中的Flt-3L會與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗小鼠Flt-3L抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素。抗小鼠Flt-3L抗體與結(jié)合在包被抗體上的小鼠Flt-3L結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物（TMB），TMB在辣根過氧化物酶的催化下現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變黃。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測OD值，F(xiàn)lt-3L濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中Flt-3L的濃度。標(biāo)本收集:1. 血清：全血標(biāo)本于室溫放置2小時或4℃后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA.Na2，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。避免使用溶血，高血脂標(biāo)本。3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS （0.01M, pH=7.4）沖洗組織，以去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣本對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。zui后將勻漿液于5000×g 離心5~10分鐘，取上清檢測。4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測。|5. 其它生物標(biāo)本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測6. 標(biāo)本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。7. 標(biāo)本收集后若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃/-80℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融，1-6月內(nèi)檢測,4℃保存的應(yīng)在1周內(nèi)進(jìn)行檢測。8. 如果您的樣本中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品zui高值，請根據(jù)實際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議先做預(yù)實驗，以確定稀釋倍數(shù)）。試驗所需自備物品:1. 酶標(biāo)儀（450nm波長濾光片）2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL3. 37℃恒溫箱, 雙蒸水或去離子水 4. 吸水紙檢測前準(zhǔn)備工作:1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋（1:25）。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應(yīng)為室溫）。3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置10分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻（濃度為1000pg/mL）。然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、0 pg/mL ，樣品稀釋液直接作為空白孔0pg/mL。如配制500pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5mL 1000pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。4. 生物素化抗體工作液：實驗前計算當(dāng)次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應(yīng)多配制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體（1:100）成工作濃度。當(dāng)日使用。5. 酶結(jié)合物工作液：實驗前計算當(dāng)次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應(yīng)多配制100-200μL。使用前15分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物（1:100）成工作濃度。當(dāng)日使用。
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據(jù)實際用量來稀釋，如200μL/管）
操作步驟:
實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μL，余孔分別加標(biāo)
準(zhǔn)品或待測樣品100μL，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育90分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中加入生物素化抗體工作液100μL（在使用前15分鐘內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1小時。
3. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩干并在吸水
紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
4. 每孔加酶結(jié)合物工作液（臨用前15分鐘內(nèi)配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育30分鐘。
5. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。
6. 每孔加底物溶液（TMB）100μL，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光孵育15分鐘左右（根據(jù)實際顯
色情況酌情縮短或延長，但不可超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止）。 7. 每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。
8. 立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度（OD值）。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測程序。
9. 實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存。
注意事項：
1. 保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
2. 酶標(biāo)板：剛開啟的酶標(biāo)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。3. 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔的加樣時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。每次的加樣時間控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔。
4. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時必須給酶標(biāo)板覆膜；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)；嚴(yán)格遵守給定的溫育時間和溫度。
5. 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。
6. 小鼠FMS樣酪氨酸激酶3配體 （Flt-3L）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒試劑配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較小，運輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用*0轉(zhuǎn)/分離心1min，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液請根據(jù)所需用量配制，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab時，一次不要小于10μL），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液。若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次用量分裝，將其放在-20～-80℃貯存。避免反復(fù)凍融。7. 顯色時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很明顯，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免顏色過深影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。
8. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。
9. 混勻：充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，使用微量振蕩器（使用zui低頻率），如無微量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。
10. 安全：試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作。特別是檢測血液或者其他體液標(biāo)本時，請按國家生物試驗室安全防護(hù)條例執(zhí)行。
11. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外）
12. 試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴(yán)禁混用，否則將影響試驗結(jié)果！
結(jié)果判斷:
1. 每個標(biāo)準(zhǔn)品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。亦可以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
3. 若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
靈敏度、檢測范圍、特異性和重復(fù)性:
● 靈敏度：zui小可測9.38pg/mL。
● 檢測范圍：15.63 – 1000pg/mL。
● 特異性：可檢測重組或天然的小鼠Flt-3L，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
● 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%。
問題分析
問題描述 可能原因 相應(yīng)對策
標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度差
吸液或加液不準(zhǔn) 檢查移液器及吸頭
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不正確 溶解標(biāo)準(zhǔn)品時稍微旋轉(zhuǎn)瓶身，輕輕混勻使粉末*溶解 洗滌不*
保證洗滌時間和洗滌次數(shù)及每孔的加液量 顯色很弱或無色
孵育時間太短 保證充足的孵育時間 實驗溫度不正確 使用推薦的實驗溫度
試劑體積不夠或漏加 檢查吸液及加液過程，保證所有試劑按順序足量添加
稀釋不正確
讀數(shù)數(shù)值低
酶標(biāo)儀設(shè)置不正確
在酶標(biāo)儀上檢查波長及濾光片設(shè)置 提前打開酶標(biāo)儀預(yù)熱 曲線偏差大 加液不正確
檢查加液情況 背景值高
檢測抗體的工作濃度過高 使用推薦的稀釋倍數(shù)
酶標(biāo)板洗滌不*保證清洗*；如果用自動洗板機(jī)，請檢查所有的出口是否有堵塞 洗液有污染
配制新鮮的洗液
靈敏度低
ELISA試劑盒保存不當(dāng) 按說明書要求保存相關(guān)試劑 讀數(shù)前未終止
OD讀數(shù)前應(yīng)在每孔中加入終止液
說明
1. 限于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平，尚不能對所有原料進(jìn)行全面的鑒定分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。
2. zui終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必準(zhǔn)備充足的待測樣品。3. 小鼠FMS樣酪氨酸激酶3配體 （Flt-3L）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒只有全部使用ElabTM試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守ElabTM試劑的實驗說明才會得到*的檢測結(jié)果。4. 有效期：6個月。
5. 本操作說明同樣適用于48T試劑盒。- 上一篇：抗壞血酸2-葡萄糖苷說明書
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